谭仁祥和梁勇团队研究成果

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周环反应是一类在反应过程中形成环状过渡态的协同反应,比如著名的[澳门新葡8455最新网站,4+2]环加成反应(Diels-Alder反应)、Cope-重排反应、Claisen-重排反应等,这些反应在有机合成中有着广泛的应用。有意思的是,在自然界中也观察到了可催化这些著名周环反应的酶。早在1965年,Woodward和Hoffmann两位诺贝尔化学奖获得者就预测了[6+4]或其它高阶环加成反应可以发生,随后在有机合成中确实观察到了[6+4]反应,但自然界中是否存在着可催化[6+4]反应的酶仍然是个谜。

图片摘要

南京大学戈惠明、谭仁祥和梁勇研究团队首次鉴定出能够催化[6+4]环加成反应的一类酶家族,相关成果“Enzyme-catalysed
[6+4] cycloadditions in the biosynthesis of natural
products”2019年3月13日在线发表在英国《自然》杂志上。南京大学助理研究员张博博士、以及博士研究生王凯标、王文和汪欣为该论文共同第一作者。戈惠明、谭仁祥、梁勇以及加州大学洛杉矶分校的Kendall
N. Houk教授为共同通讯作者。

由细菌合成的多环芳香聚酮类化合物是抗肿瘤、抗菌药物的重要来源,典型的例子包括阿霉素、四环素等。这类分子的基本碳骨架大多由细菌的II型聚酮合成酶(Type
II
PKS)负责构建,但后期的各类氧化重排反应是此类分子结构和生物活性多样性的关键,理解氧化重排的酶学机制,对于它们的结构以及构效关系的研究至关重要。Chartreusin是一种从放线菌中发现的强效抗肿瘤候选药物,它可与DNA结合,通过自由基断裂DNA,进而诱导肿瘤细胞凋亡。尽管Chartreusin的生物合成基因簇早在2005年就已被德国科学家Christian
Hertweck研究组克隆鉴定,但其具体的合成步骤特别是关键的氧化重排反应依然不明。

该团队在前期工作中,从海洋放线菌中发现了一个具有抗幽门螺旋杆菌活性的新颖大环内酯化合物命名为streptoseomycin,根据其结构推断,它在微生物体内的合成过程中可能涉及[4+2]环加成反应。为鉴定此过程,他们比较分析了streptoseomycin以及其结构类似物nargenicin的生物合成基因簇,推测一个未知功能的同源蛋白StmD、NgnD很有可能分别负责streptoseomycin和nargenicin中的环化反应。然而,敲除stmD基因并未得到预料中的环化产物前体3,而得到了线性化合物4和5,这很可能是化合物3环内双键较多,张力较大,自发水解开环所致。研究人员设计了一个在微生物体内验证StmD功能的实验,首先敲除了基因簇上大部分基因,仅留下聚酮合成酶基因,此突变株只产生化合物4;当将stmD基因回补回去时,得到了化合物6−8,其中化合物7不稳定,可经Cope重排转化成6。该结果表明,聚酮合成酶的直接产物是3,若无下游其它酶存在时,3将发生水解开环而生成4;若再引入StmD,则催化发生周环反应,奇怪的是,该酶不仅催化了[4+2]反应,也催化了[6+4]反应。

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Figure 1. A) Examples of natural products synthesized by type II PKSs
where oxidative rearrangement (highlighted in red) play a key role in
generating structural complexity. B) Biosynthesis of chartreusin

天然产物生物合成中的环加成

近日,南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室的戈惠明和谭仁祥研究团队揭示了chartreusin生物合成末期的一关键的氧化重排反应的酶学机制。该研究成果以Molecular
Basis for the Final Oxidative Rearrangement Steps in Chartreusin
Biosynthesis于2018年8月1日在线发表于《美国化学会志》(Journal of the
American Chemical
Society),论文链接为

随后,研究人员设计了两步串联的酶反应在体外来验证周环酶的催化功能。首先,通过聚酮合成酶上的硫酯酶结构域催化链状化合物4-SNAC环化形成3,当同时加入StmD或NgnD时,反应体系中观察到了化合物6−8的生成,确证StmD或NgnD可同时催化[4+2]和[6+4]反应。此外研究人员以StmD为探针从公共基因组数据库中,挖掘鉴定出了另外三个可催化此反应的酶。

研究人员从一高产chartreusin的海洋放线菌出发,通过对其生物合成相关基因的敲除,合成中间体的分离、鉴定,化学回补以及异源生物转化等方法,确定了五环邻醌化合物为关键中间体,并且从2到最终产物chartreusin的转化是由一双加氧酶(dioxygenase)ChaP介导的。

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然而,在体外反应中,ChaP蛋白却未能将化合物2转化为化合物1。分析显示,ChaP属于Vicinal
Oxygen Chelate蛋白超家族,该超家族的蛋白功能多样,其中catechol
2,3-dioxygenase可催化儿茶酚上与酚羟基相邻的碳碳键的断裂,研究人员推测,ChaP很有可能与catechol
2,3-dioxygenase催化反应的断键方式类似,但不同点在于:儿茶酚化合物比邻苯醌化合物多了2个电子。最后,研究人员发现ChaP的催化需要黄素和黄素还原酶(flavin
reductase)的参与,即需要黄素活化的氧而非普通的氧气作为此反应的氧化剂,但有趣的是,ChaP未能预测出黄素的结合位点。

反应热力学和动力学的DFT计算

为进一步研究该反应的催化机理,研究人员获得了ChaP蛋白的晶体,经分子对接和点突变实验,阐明了此类新型氧化酶的反应机制,即:底物2中的两个酮羰基与ChaP中的二价铁结合后,FAD活化的过氧化氢进入活性中心,断裂C-C键,生成IV;紧接着,另一分子过氧化氢进入活性中心,发生第二次C-C键断裂,放出一份子二氧化碳,并关环形成最终产物1。

为了更好地理解[6+4]、[4+2]环加成反应和[3,3]-Cope重排反应之间的相互关系,研究人员通过密度泛函理论计算了反应的热力学和动力学。有趣的是,底物3越过单一过渡态后可歧化成两个方向,分别生成[6+4]、[4+2]反应产物,由于[6+4]化合物在热力学上更稳定,[4+2]产物可再经Cope重排自发转化成[6+4]产物。此理论计算结果与实验观察结果相吻合,进一步证明了之前的推断。

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酶和催化活性位点的结构分析

Figure 2. Structures of ChaP and its homologous enzymes and proposed
catalytic mechanism. The dimeric structure of ChaP (PDB: 6A4Z) , ChaP-H1
(PDB: 6A52) , and ChaP-H2 (PDB: 6A4X) superimposed image of ChaP , and
its homologs ChaP-H1 and ChaP-H2 (aquamarine) and their symmetric
monomer was marked as light gray. Colored surface of ChaP and the
putative substrate position by docking. The molecular surface was
colored by amino acid hydrophobicity according to the Kyte-Doolittle
scale: the hydrophobicity scale from least to most was colored blue to
orange to red with zero hydrophobicity colored as white. Amino acid
residues in ChaP that form the active site. Residues from two monomers
were colored in gold and silver, respectively. Proposed mechanism for
ChaP-catalyzed reaction.

最后,研究者获得了StmD、NgnD和101015D三个蛋白的晶体来进一步研究该反应的催化机理。通过分子对接、计算机模拟和点突变实验,阐明了此类新型环加成酶的反应机制。M69中富含电子的硫原子会特定的指向过渡态中部分带正电的双烯部分,从而产生有利的静电作用;同时反应物中部分带负电的三烯酯会与W67上的芳香环产生π–π堆叠相互作用,来稳定过渡态并加速整个反应的进行。此外,Y55和Y13也会通过分子间氢键和CH–π相互作用来催化反应。

南京大学生命科学学院博士研究生王以爽和助理研究员张博是该论文的共同第一作者,南京大学戈惠明教授、谭仁祥教授和南京中医药大学朱家鹏教授是论文的共同通讯作者;主要合作者包括:上海科技大学赵素文教授,南京大学化学化工学院梁勇教授、刘芳博士,以及中国科学院热带农业研究院的黄慧琴教授等。该工作得到国家自然科学基金委优青项目、重点项目、面上项目以及中央高校基本科研业务费等的资助,在此表示感谢。

综上所述,研究人员巧妙设计实验,通过体内敲除基因、体外酶催化反应、量子化学计算、分子动力学模拟以及蛋白晶体的研究等,表征了首例可催化[6+4]/[4+2]环加成反应的酶。这类酶的发现将进一步拓展人们对周环反应酶的认识,启发科学家们将来利用和改造周环反应酶来实现有价值的分子转化。

(生命科学学院 科学技术处)

该研究得到了国家重点研发计划,国家自然科学基金委优青项目、重点项目,江苏省特聘教授计划等的资助,特别感谢南京大学配位化学国家重点实验室以及医药生物技术国家重点实验室,以及人工微结构科学与技术协同创新中心高性能计算中心和南京大学高性能计算中心提供的服务。